Главное меню
Главная О сайте Добавить материалы на сайт Поиск по сайту Карта книг Карта сайта
Книги
Аналитическая химия Ароматерапия Биотехнология Биохимия Высокомолекулярная химия Геохимия Гидрохимия Древесина и продукты ее переработки Другое Журналы История химии Каталитическая химия Квантовая химия Лабораторная техника Лекарственные средства Металлургия Молекулярная химия Неорганическая химия Органическая химия Органические синтезы Парфюмерия Пищевые производства Промышленные производства Резиновое и каучуковое производство Синтез органики Справочники Токсикология Фармацевтика Физическая химия Химия материалов Хроматография Экологическая химия Эксперементальная химия Электрохимия Энергетическая химия
Новые книги
Петрянов-соколов И.В. "Научно популярный журнал химия и жизнь выпуск 2" (Журналы)

Петрянов-соколов И.В. "Научно популярный журнал химия и жизнь выпуск 1" (Журналы)

Петрянов-соколов И.В. "Научно популярный журнал химия и жизнь выпуск 12" (Журналы)

Петрянов-соколов И.В. "Научно популярный журнал химия и жизнь выпуск 11" (Журналы)

Петрянов-соколов И.В. "Научно популярный журнал химия и жизнь выпуск 10" (Журналы)
Книги по химии
booksonchemistry.com -> Добавить материалы на сайт -> Биохимия -> Аркадьева З.А. -> "Промышленная микробиология" -> 48

Промышленная микробиология - Аркадьева З.А.

Аркадьева З.А., Безбородое А.М., Блохина И.Н. Промышленная микробиология — M.: Высш. шк., 1989. — 688 c.
ISBN 5—06—001482—7
Скачать (прямая ссылка): promishmicrobiol1989.pdf
Предыдущая << 1 .. 42 43 44 45 46 47 < 48 > 49 50 51 52 53 54 .. 297 >> Следующая

102
Таблица 5.1. Промоторы, используемые для обеспечения транскрипции чужеродных генов в клетках Escherichia coli
Промотор Транскрибируемый геи Обеспеченный ВЫХОД белка (мол/кл)
lac UV5 Интерферон лейкоцитов человека aF СІ-репреееор фага К сго-репрессор фага 1K Гормон роста человека (5-.....10) 10;) (30—90) 103 200 103
IrpOP Интерферон ? фибробластов человека Интерферон аА лейкоцитов человека Поверхностный антиген вируса гепатита В Е-цеиь иммуноглобулина человека 20 103 100 H)3 500 1С)3 10е (18% белка)
«tac OP» СІ-репреесор фага К 1 10° (30% белка)
Pi. Интерферон ? фибробластов человека Фрагмент Клейова с ДНК-пол и мер азы Поверхностный антиген вируса ящура 200 К)3 200 K)3 1,5 10"
T5 P25 Y - и і іте р ф е ро 11 ч ел о век а 1 10° (16% белка)
Третий этап конструирования — это подбор клетки-реципиента, или клетки-хозяина. Выход белка связан не только с интенсивностью матричных процессов, но и со стабильностью мРНК и самого конечного продукта — белка.
Так, было обнаружено, что у клеток Е. coli, дефектных по генам РНК-азы I (ma ) и полинуклеотидфосфорилазе (рпр-), резко возрастает экспрессия некоторых эукариотических генов. Такой эффект первоначально был обнаружен для клонированных генов Neurospora crassa, а затем для дрожжевого гена ими-дозолилглицерофосфатдегидрогеназы (IGP). Активность IGP в мутаптиых клетках Е. coli возрастала в три — пять раз, что было связано со стабилизацией мРНК, время полужизни которой возрастало от 1,5 до 18,7 мин. Интересно, что при этом стабильность мРНК Е. coli в мутантных штаммах не изменялась.
Подавление протеолитической активности клетки может сильно повысить выход целевого белка. Так, введение гена pin (pro-ieolis inhibition) фага Т4 на плазмиде pBR325 в клетки Е. coli повысило выход (-^-интерферона под контролем lac-промотора в четыре — восемь раз и под контролем lac-промотора в пять раз. Мутации, подавляющие протеолиз в клетках Е. coli (типа Ion), также положительно сказываются на выходе чужеродных белков.
103
Один из приемов, позволяющих снизить протеолиз в клетке, — это получение крупных химерных белков или тандемносое-диненных белков. Так, имеется сообщение о том, что тандемная дупликация, или тандемный тройной ген проинсулина в клетках Е. coli обеспечивает защиту такого белка от протеолитической деградации. Итак, важным условием оптимальной экспрессии гена является правильный выбор реципиентной клетки, которая должна обеспечить стабильность чужеродной мРНК и минимальную протеолитическую деградацию белкового продукта.
Очень важное условие промышленной ферментации - стабильность созданного штамма. Обычно клетки микроорганизма теряют плазмиды с определенной частотой на генерацию. Кроме того, с определенной частотой происходит структурная реорганизация генетического материала рекомбинантных илазмид. Оба процесса могут привести к утере способности микрооганизма производить нужный белок. Структурные перестройки происходят в 100—1000 раз реже, чем утрата клетками плазмид. Плазмиды обычно, помимо чужеродного гена, несут также гены, ответственные за устойчивость к определенным антибиотикам. Поэтому простейшим способом сохранения штамма является ферментация в присутствии соответствующего антибиотика, что предотвращает накопление в популяции бесплазмидных штаммов. Число клеток, утративших плазмиды в неселективных условиях, составляет 10 3—Ю""4 на генерацию. Если при культивировании продуцентов образуется небольшое количество белка (например, в случае получения интерферона или гормонов) и объем ферментера обычно не превышает 1 мл, селективное давление с помощью антибиотиков не является трудной технической проблемой. Приемы стабилизации, необходимые при крупномасштабных ферментациях, будут рассмотрены ниже.
Наконец, штамм-продуцент и условия культивирования должны быть оптимальными для последующих технологических операций но очистке белка. Например, использование в качестве хозяина дрожжей облегчает стадию сепарации биомассы; они имеют клетки крупных размеров (по сравнению с бактериями). В составе клеточных стенок Е. coli содержатся нирогеииые и токсичные вещества. Для облегчения процедуры очистки белка желательно в качестве продуцентов использовать бактерии, не содержащие вредных веществ.
Очистка человеческого белка после биосинтеза в клетках микроорганизмов весьма сложная задача, так как требует получения гомогенного препарата из смеси, содержащей около 3 тыс. белков. Примеси бактериальных белков в готовом продукте недопустимы, особенно в препаратах, предназначенных для инъекции.
В этой связи заманчивой является перспектива организации биосинтеза и экскреции необходимого белка в среду культивирования. Известно, что клетки Bacillus subtilis, например, способны выделять в среду большое число экзофермептов амилазы, протеазы, рибонуклеазы и т.д., причем количество некоторых из
104
СЕКРЕТОРНЫЙ BEKlOP 6AU1HJIJJ
Структурный ген сигнального neifmuda (X-амилазы -Инициирующий нооон
Сайт сЗязывания с риоосомой
Промотор _ транскрипции
CIaJ
бсо И-сайт Зля клонироійнип структурного гена Велка 'например интерферона или проинсу/fOHa)
Предыдущая << 1 .. 42 43 44 45 46 47 < 48 > 49 50 51 52 53 54 .. 297 >> Следующая

Авторские права © 2011 BooksOnChemistry. Все права защищены.
Реклама