Главное меню
Главная О сайте Добавить материалы на сайт Поиск по сайту Карта книг Карта сайта
Книги
Аналитическая химия Ароматерапия Биотехнология Биохимия Высокомолекулярная химия Геохимия Гидрохимия Древесина и продукты ее переработки Другое Журналы История химии Каталитическая химия Квантовая химия Лабораторная техника Лекарственные средства Металлургия Молекулярная химия Неорганическая химия Органическая химия Органические синтезы Парфюмерия Пищевые производства Промышленные производства Резиновое и каучуковое производство Синтез органики Справочники Токсикология Фармацевтика Физическая химия Химия материалов Хроматография Экологическая химия Эксперементальная химия Электрохимия Энергетическая химия
Новые книги
Сидельковская Ф.П. "Химия N-вннилпирролидона и его полимеров" ()

Райт П. "Полиуретановые эластомеры" (Высокомолекулярная химия)

Сеидов Н.М. "Новые синтетические каучуки на основе этилена и олефинов" (Высокомолекулярная химия)

Поляков А.В "Полиэтилен высокого давления. Научно-технические основы промышленного синтеза" (Высокомолекулярная химия)

Попова Л.А. "Производство карбамидного утеплителя заливочного типа" (Высокомолекулярная химия)
Книги по химии
booksonchemistry.com -> Добавить материалы на сайт -> Биохимия -> Данилин Н.Ф. -> "Методические рекомендации по молекулярно-генетическим основам микробиологии" -> 66

Методические рекомендации по молекулярно-генетическим основам микробиологии - Данилин Н.Ф.

Данилин Н.Ф. Методические рекомендации по молекулярно-генетическим основам микробиологии — Ленинград, 1982. — 416 c.
Скачать (прямая ссылка): metodrekomendaciipomolekulyarnim1982.pdf
Предыдущая << 1 .. 60 61 62 63 64 65 < 66 > 67 68 69 70 71 72 .. 106 >> Следующая

- 20 мл;
5) 96% и 70% этанол по 50 мл;
?
6) 30%на0Н - 5 мл; "
' 0
7) 1% сульфат меди - 2 мл.
8) дифениламиновый реактив (реактив Дише): I г "
дифениламина растворяют в 100 мл ледяной
уксусной кислоты. К раствору добавляют 2,75 г концентрированной серной кислоты (с плотностью^,^,836.);
У) 0,4% КаОН - 10 мл
i
275
Разрушение биомассы и выделение ДНК
Бактериальную массу залить раствором 0,1 М HaGl +0,014 М цитрат На (30 мл раствора на 1 г биомассы), тщательно перемешать и центрифугировать в стеклянных центрифужных стаканах на холоду 20 мин. при 3000 об/мин. Стаканы тщательно уравновесить! Надосадочную жидкость слить, а биомассу промыть дважды.
Промытую биомассу перенести в химический стакан суспендировать в 2 М наСх (1:5 по объему) и разрушать в дезинтеграторе 10 мин. Разрушенную биомассу слить в стеклянный химический стакан и перемешивать магнитной мешалкой в течение 50 мин на холоду. При этом происходит экстракция дезоксирибонуклеопротеиново-го комплекса из разрушенных клеток. Полученную массу центрифугировать в стеклянных центрифужных стаяанах 20 мин при 3000 об/мин на холоду. Надосадочную жидкость слить и наслоить на нее 2 объема охлажденного 96% этанола. При этом в осадок выпадает ДНП.
Депротеинизапия и осаждение ДНК
Жидкость с осадка слить декантацией, осадок растворить в
0,1 М iraCx+0,014 М цитрата на (1:2 по объему). На полученный раствор наслоить 2 объема охлажденного 96 % этанола. Жидкость с полученного осадка слить и повторно растворить осадок в смеси 0,1 М наСхи 0,014 М цитрата 1;а (1:1 по объему), добавить равный объем смеси хлороформ-из о амиловым спирт. Смесь встряхивать в течение 30 мин в колбе с притертой пробкой. Полученную суспензию центрифугировать в стеклянных стаканах на холоду при ЗОООоб/мин. В результате центрифугирования образуется 3 слоя: верхний - водносолевой, содержащий нуклеиновые кислоты;
277
средний - белок и нижний - хлороформ. Верхний слой осторожно отсосать пастеровской пипеткой в колбу с притертой пробкой и снова добавить хлороформ - изоамиловый спирт и всю операцию повторить. Депротеинизациго проводят 2-3 раза, пока на границе двух фаз не останется белка. После последней депротеинизации нуклеиновую кислоту осаждают из верхнего водносолевого раствора наслаиванием двух объемов этанола. При помешивании двух слоев стеклянной палочкой ДНК наматывается на палочку в виде нитевидного осадка и легко отделяется. Полученную ДНК промыть в небольшом количестве (3-5 мл) 70^ этанола. Половину осадка растворить в^ 0,2 М на(J1 . Раствор и вторую половину осадка использовать для изучения ДНК.
Характеристика препарата ДНК
а) качественная реакция на ДНК
К I мл 0,4^ раствора приливают равный объем дифениламино-вого реактива. Осадок, выпадающий вначале, растворяют в последующих порциях реактива, после чего его нагревают в теченче т5-20 мин в кипящей водяной бане. Появляется синее окрашивание в результате взаимодействия дифениламина с дезоксирибозо" или ДНК.
б) оценка чистоты препарата
Чистоту выделенного препарата определяют по спектральной кривой поглощения в ультрафиолетовой области спектра по величинам отношений E25n;Ej>3Q и EggQ^gQ. Для препарата ДНК эти показатели должны быть в пределах 2,±-2,4.
Раствор ДНК налить в кювету спектрометра и измерить плотность при длине волны 230,260,260 нм. Расчитать отношения
^бО^ЗЭ и ^бО^бО*
278
в) определение примеси белка.
Для качественного определения белка используют биуретовую реакцию.К 0,5 мл раствора ДНК прибавить Т мл ЗО'Я раствора ЫаШ, тщательно перемешать и добавить 2-3 капли 1% раствора сульфата меди. Хорошо перемешать. При наличии белка развивается красно-фиолетовое окрашивание. (Химизм реакции описан в теме 8.2.)
г) количественное определение ДНК (по Дише).
К I мл раствора ДНК прилить двойной объем реактива Дише, нагреть 10 мин на кипящей водяной бане, затем охладить. Жидкость окрашивается в синий или сине-фиолетовый цвет. Измерить поглощение раствора в фотоэлектроколориметре с красным светофильтром против контроля (реактив Дишр).
с
Содержание ДНК в исследуемом растворе расчитывают по калибровочной кривой, составленной по стандартному раствору натриевой соли дезоксирибонуклеиновой кислоты с известным содержанием фосфора (9,89-10,0'? в пересчете на чистую ДНК).
Механизм реакции заключается в образовании оксилевулиново-го альдегида и конденсации последнего с дифениламином.с образованием окрашенного соединения.
Оформление результатов
% содержание
ДНК
^60
Е230
^60
*280
279
Литература
Дроздов Н.С., Матеранская Н.П. Практикум по биологической химии. М., "Высшая школа", 1970.
ДроздовА.И. Методы выделения антигенов из патогенных грибов (методическое пособие). Ленинградский государственный ордена Ленина институт усовершенствования врачей им.С.М.Кирова, T97I.
К а р р е р П. Курс органической химии. Л. ,Тосхимиздат",1960. ЛенинджерА. Биохимия. М.,1976.
Методика количественной бумажной хроматографии сахаров, органических кислот и аминокислот у растений. М., Л.."Издательство академии наук СССР", 1962.
Методы химии углеводов (под редакцией член-корр. АНСССР Кочеткова Н.К.). М., "Мир",1967.
Предыдущая << 1 .. 60 61 62 63 64 65 < 66 > 67 68 69 70 71 72 .. 106 >> Следующая

Авторские права © 2011 BooksOnChemistry. Все права защищены.
Реклама