Главное меню
Главная О сайте Добавить материалы на сайт Поиск по сайту Карта книг Карта сайта
Книги
Аналитическая химия Ароматерапия Биотехнология Биохимия Высокомолекулярная химия Геохимия Гидрохимия Древесина и продукты ее переработки Другое Журналы История химии Каталитическая химия Квантовая химия Лабораторная техника Лекарственные средства Металлургия Молекулярная химия Неорганическая химия Органическая химия Органические синтезы Парфюмерия Пищевые производства Промышленные производства Резиновое и каучуковое производство Синтез органики Справочники Токсикология Фармацевтика Физическая химия Химия материалов Хроматография Экологическая химия Эксперементальная химия Электрохимия Энергетическая химия
Новые книги
Сидельковская Ф.П. "Химия N-вннилпирролидона и его полимеров" ()

Райт П. "Полиуретановые эластомеры" (Высокомолекулярная химия)

Сеидов Н.М. "Новые синтетические каучуки на основе этилена и олефинов" (Высокомолекулярная химия)

Поляков А.В "Полиэтилен высокого давления. Научно-технические основы промышленного синтеза" (Высокомолекулярная химия)

Попова Л.А. "Производство карбамидного утеплителя заливочного типа" (Высокомолекулярная химия)
Книги по химии
booksonchemistry.com -> Добавить материалы на сайт -> Биохимия -> Данилин Н.Ф. -> "Методические рекомендации по молекулярно-генетическим основам микробиологии" -> 76

Методические рекомендации по молекулярно-генетическим основам микробиологии - Данилин Н.Ф.

Данилин Н.Ф. Методические рекомендации по молекулярно-генетическим основам микробиологии — Ленинград, 1982. — 416 c.
Скачать (прямая ссылка): metodrekomendaciipomolekulyarnim1982.pdf
Предыдущая << 1 .. 70 71 72 73 74 75 < 76 > 77 78 79 80 81 82 .. 106 >> Следующая

Ауксотрофным называют мутант, требующий дополнительные факторы для своего роста, в которых не нуждается дикий штамм -прототроф. Выделять ауксотрофные мутанты из популяции протот-рофов довольно сложно, поэтому прибегают к различным методам, позволяющим увеличить относительное количество ауксотрофныя мутантов в популяции.
Один из широко применяемых в этих целях методов - так называемый полуселективный метод, основан на действии пенициллина, который в больших концентрациях действует не только на грамположительные, но и грамотрицательные бактерии. Пенициллин вызывает гибель растущих бактерий, но не оказывает влияния на клетки с подавленным метаболизмом. Поэтому если смесь ауксот-
3TS
рофньгх и прототрофных клеток поместить в среду, дефицитную по тем или иным питательным веществам и содержащую летальную дозу пенициллина, то прототрофы погибнут, как только начнут размножаться, жизнеспособными останутся только ауксотрофы, которые не смогут расти в этих условиях.
Иель работы - получение и идентификация ауксотрофных мутантов E.coTi К-Т2 под действием нитрита натрия.
Материалы.
Питательные среды. Полноценная среда - бульон и агар Хоттингера, содержащий 0,2*? глюкозы. Минимальная среда - сре-0 да Гловера (в г/л дистиллированной воды): нН^СТ -3,0; -
2,0; - 3,0; КН^РО^ - Т,0; ugSO^'THgO - 0,1,
глюкозы - 2,0. Селективные среды. Для приготовления селективных сред в минимальную среду Гловера вносят необходимые соединения в следующих количествах (мг/л): аминокислоты - 100, витамины - 10, азотистые основания и нуклеозиды - 20. Растворы этих веществ и глюкозы готовят на дистиллированной воде и стерилизуют пропусканием через бактериальный фильтр.
Посевной материал. Взвесь Т8-часовой культуры E.coli , содержащая 2 млрд клеток в Т мл.
Постановка опыта. Суспензию клеток исходного штамма обрабатывают нитритом натрия и выращивают на полноценной среде для фенотипического проявления мутаций. Затем клетки для истощения эндогенных веществ переносят в минимальную среду, где клетки обрабатывают пенициллином. Чтобы определить содержание жизнеспособных клеток, проводят посев на агаризованную полноценную среду из следующих вариантов суспензий:
Т. Исходной, не обработанной мутагеном.
ЗТ7
2. Обработанной нитритом натрия.
3. После подращивания на полноценной среде
4. Обработанной пенициллином.
Из каждого варианта отсеивают по ТОО колоний на плотную полноценную и минимальную среды. Для всех вариантов определяют мутагенный эффект, а также летальный эффект мутагена для 2-го варианта сравнительно с 1-ым и летальный эффект пенициллина для 4-го варианта в сравнении с 3-им. Идентификацию ауксотроф-ных мутантов, полученных из рассева второй пробы, проводят на среде Гловера с добавкой комбинаций различных питательных веществ.
Обработка бактериальных клеток нитритом натрия. К 0,5 мл суспензии клеток добавляют 0,5 мл 0,03 М нитрита натрия и выдерживают 30 мин при 37°. Затем для прекращения действия нитрита к суспензии добавляют 8 мл фосфатного буфера с pH 7,0. При этом pH мутаген неактивен. Затем клетки отмывают 2 раза при центрифугировании й фосфатном буфере pH 7,0 и осадок ресуспен-дируют в 0,5 мл того же буфера. Контролем служит 0,5 мл необработанной взвеси клеток.
Для изучения летального и мутагенного действия нитрита натрия контрольную и обработанную мутагеном суспензии высевают на поверхность плотной полноценной среды в чашках Петри. Предварительно суспензию разбавляют: контрольную в ТОО раз,а обработанную мутагеном в 1000 раз. Засевают по 0,1 мл на чашку, по;6 чашек на контроль и опыт. Выращивание при 37° 24 часа.
0,05 мл обработанной мутагеном разведенной суспензии переносят микропипеткой в пробирку с 5 мл полноценной среды. Пробирку ставят на качалку при 37° на 18-20 часов.
318
Обработка клеток пенициллином.
Культуру, выросшую в.пробирке с 5 мл бульона, центрифугируют, клетки отмывают фосфатным буфером pH 7,0 и ресуспензируют в исходном объеме того же буфера. После этого для истощения эндогенных запасов питательных веществ вклетках 0,05 мл такой суспензии переносят в пробирку с 5 мл минимальной среды и ставят на качалку при температуре 37° на 3 чала. Из оставшейся
7
суспензии делают разведения до 10 и из двух последних разведений по 0,1 мл в трех повторностях для-определения эффекта под-зщивания высевают в чашки с полноценной средой. Через 3 часа в пробирку, находившуюся на качалке, вносят I мл раствора пенициллина (100000 ед/мл), оставляют на качалке еще на 2 часа, затем суспензию центрифугируют, клетки отмывают фосфатным буфером pH 7,0 и ресуспензируют в 5 мл этого же буфера. После
"_4
этого делают разведения до 10 и два последних разведения по 0,1 мл в трех повторностях высевают на чашки с полноценной питательной средой. Чашки оставляют при 37° на 24 часа.
Определение летального действия нитрита натрия.
Просматривают все чашки с выросшими колониями. В каждом варианте выбирают одно наиболее удачное разведение и подсчитывают число живых клеток в I мл суспензии. Результаты вносят в таблицу.
Определение летального эффекта нитрита натрия и пенициллина
Предыдущая << 1 .. 70 71 72 73 74 75 < 76 > 77 78 79 80 81 82 .. 106 >> Следующая

Авторские права © 2011 BooksOnChemistry. Все права защищены.
Реклама