|
Синтез полисахаридов - Кочетков Н.К.ISBN 5-02-001857-0 Скачать (прямая ссылка):  В связи с этим существенным достижением явилась разработка нового метода синтеза полипренилпирофосфатолигосахаридов, основанного на взаимодействии незащищенного олигосахаридфосфата с активированным фосфатом полипренола, что достигается переводом последнего в соответствующий фосфоимидазолид (схема 4) [18]. Так, например, аммонийная соль полипренилфосфата 2 обрабатывается М,1Ч'-карбонил-диимидазолом или 1Ч,М'-сульфинилдиимидазолом и образовавшийся полипренилфосфоимидазолид 3 при взаимодействии с бистриалкилам-монийной солью Р-0-маннопиранозил-( 1 -4)-а-Ь-рамнопиранозил-( 1 -3)-а-D-галактопиранозилфосфата 4 в смеси тетрагидрофуран-диметилсуль-фоксид дает соответствующий полипренилпирофосфатолигосахарид 5, который не нуждается в депротектировании и очищается ионообменной хроматографией на ДЕАЕ-целлюлозе. Метод имеет общий характер и с его помощью химическим путем были синтезированы различные по Схема 4 CHjOH CHjOH о II RO-P-O l О 2 CH2OH CHjOH но он 5 он о- о- R = полмпренил строению полипренилпирофосфатолигосахариды, которые могут служить субстратами в реакции ферментативной полимеризации. Этим путем были приготовлены производные ди- и трисахаридов, составляющих фрагменты повторяющихся звеньев полисахаридов из некоторых сальмонелл и их аналогов (см., например, [19]), в том числе содержащие радиоактивную метку [20]. Границы химико-ферментативного подхода к синтезу регулярных полисахаридов очень сильно расширяются благодаря тому, что для получения полипренилпирофосфатных производных олигосахаридов кроме чисто химического синтеза широко могут быть применены схемы с частичным использованием ферментативных реакций. Поэтому имеются широкие возможности построения олигосахаридного звена введением в его основную цепь с помощью ферментативных реакций моносахаридных остатков, не входящих в состав природных полисахаридов. Таким путем, например при использовании соответствующих гликозилтрансфераз и нуклеозиддифосфатсахаров, была получена серия аналогов полипренил-пирофосфатолигосахаридов типа Sug3-Rha-Sugi-0-P-0-P-Pre, содержащих вместо D-галактозы (Sugj) остатки D-фукозы, D-талозы и D-глюкозы, а вместо D-маннозы (Sug3) - остаток D-глюкозы [21]. Другим интересным путем модификации полипренилпирофосфатолигосахаридов с использованием ферментативных реакций является введение в линейный олигосахаридный фрагмент заместителей. Так, в линейный трисахарид типа Man-Rha-Gal был введен в качестве боковой группы остаток абеквозы [22]. Таким образом, сочетание химического синтеза с одновременным использованием ферментативных реакций дало возможность получить довольно широкий круг полипренилпирофосфатолигосахаридов, различаю- 200 щихся структурой углеводной части. Эти соединения оказались важным нструментом для первых принципиальных оценок границ реакции ферментативной полимеризации и, следовательно, химико-ферментативного етода синтеза полисахаридов. 8.2. Ферментативная полимеризация Ключевой стадией химико-ферментативного синтеза регулярных полисахаридов, которая определяет эффективность и границы его препаративного использования, является реакция полимеризации полипренил-пирофосфатолигосахаридов. Эта стадия проходит под действием бактериальных полимераз, которые встроены в цитоплазматическую мембрану стенки микроорганизма и прочно с нею связаны. Многочисленные попытки отделить фермент от мембраны ("солюбилизация") для получения его в очищенном виде не дали положительного результата, так как фермент быстро терял свою активность, что связано, скорее всего, с изменением конформации белковой цепи, происходящим при отрыве фермента от фиксирующей его матрицы. В то же время очистка полимеразы является существенным моментом не только для повышения ее активности. Дело в том, что в бактериальной стенке всегда присутствует очень небольшое количество природного эндогенного полисахарида, который после проведения полимеризации с использованием полимеразы бывает трудно отделить от получаемого синтетического биополимера. Поскольку при получении полимеразы из микробной массы некоторое количество эндогенного полисахарида может попасть в препарат полимеразы, это может сильно затруднить оценку результатов ферментативной полимеризации и снизить препаративную ценность метода. В связи с этим была разработана методика, позволяющая получать очищенный препарат полимеразы, который имеет значительно более высокую активность, практически не содержит примеси эндогенного полисахарида и вполне пригоден для препаративного использования [23].
Авторские права © 2011 BooksOnChemistry. Все права защищены. |
|
|||||||||||||||||||||||||
|
|
|
||||||||||||||||||||||||||
