Главное меню
Главная О сайте Добавить материалы на сайт Поиск по сайту Карта книг Карта сайта
Книги
Аналитическая химия Ароматерапия Биотехнология Биохимия Высокомолекулярная химия Геохимия Гидрохимия Древесина и продукты ее переработки Другое Журналы История химии Каталитическая химия Квантовая химия Лабораторная техника Лекарственные средства Металлургия Молекулярная химия Неорганическая химия Органическая химия Органические синтезы Парфюмерия Пищевые производства Промышленные производства Резиновое и каучуковое производство Синтез органики Справочники Токсикология Фармацевтика Физическая химия Химия материалов Хроматография Экологическая химия Эксперементальная химия Электрохимия Энергетическая химия
Новые книги
Петрянов-соколов И.В. "Научно популярный журнал химия и жизнь выпуск 2" (Журналы)

Петрянов-соколов И.В. "Научно популярный журнал химия и жизнь выпуск 1" (Журналы)

Петрянов-соколов И.В. "Научно популярный журнал химия и жизнь выпуск 12" (Журналы)

Петрянов-соколов И.В. "Научно популярный журнал химия и жизнь выпуск 11" (Журналы)

Петрянов-соколов И.В. "Научно популярный журнал химия и жизнь выпуск 10" (Журналы)
Книги по химии
booksonchemistry.com -> Добавить материалы на сайт -> Биохимия -> Лазуркин Ю.С. -> "Физические методы исследования белков и нуклеиновых кислот" -> 35

Физические методы исследования белков и нуклеиновых кислот - Лазуркин Ю.С.

Лазуркин Ю.С. Физические методы исследования белков и нуклеиновых кислот — М.: Наука, 1967. — 342 c.
Скачать (прямая ссылка): afizsvoystvapentanola1967.djvu
Предыдущая << 1 .. 29 30 31 32 33 34 < 35 > 36 37 38 39 40 41 .. 126 >> Следующая

91
Рассмотрим два известных в настоящее время варианта методики на примере исследования, проведенного совместно с Р. Б. Хесиным н іЧ. Ф. Шемякиным [56].
Одни нз этих методических вариантов заключается в том, что молекулы извлекают нз раствора путем нанесення на его поверхность белковой пленки. В наших исследованиях для этих целей использовали раствор нуклеиновой кислоты в аммоний-ацетатном буфере (0,01 М, pH 7,0) с концентрацией 1—2 мкг/мл. Раствор наливали в плоскую круглую кювету площадью 80 см2 и на него наслаивали 0,02%-ный раствор цнтохрома с в том же
6 5.
Рис. 14. Нанесение белковой пленки
/ — пипетка; 2 — стеклянная палочка; 3 — белковая пленка; 4 — палочка из пластмассы; 5—вода; 6 — кювета
буфере, но 0,1 М, Белковую пленку наносили прн помощи стеклянного столбика, по которому спускали 0,1—0,2 мл раствора белка (рнс. 14). За образованием пленки следили по движению частиц талька, насыпанных на поверхность раствора. Пленку выдерживали на поверхности раствора 30 мнн. Часть молекул нуклеиновой кислоты взаимодействовала с белком и извлекалась из раствора. Пленку переносили на сетки с угольной пленкой, касаясь последними белковой пленки, обезвоживали абсолютным спиртом и высушивали на фильтровальной бумаге.
При другом методическом варианте готовили смесь, содержащую 0,5 мкг нуклеиновой кислоты и 0,2 мкг цнтохрома с в 1 мл 2 ¦M аммоннй-ацетатного буфера (pH 7,0). Смесь выдерживали в течение 4—5 мнн. н затем наслаивали 0,3—0,4 мл на поверхность дистиллированной воды илн 0,01 M аммоний-ацетатного буфера. Воду илн буфер наливали в плоскую прямоугольную кювету площадью около 800 см2. После образования пленки ее при помощи стеклянной палочки поджимали на
92
Рис. 13 Фрагмент молекулы ДНК фага Т2. Обработка по ь.етодике Кляйніїг ндга с последующим оттенением вращающегося образца
Рис. 16. Фрагмент молекулы ДНК фага Т2. Обработка по методике Кляйншмидта с последующие оттенешіем в одном направлении. Выявляются только участки молеьул, ориентированные поперек направления оттенения
площади, Перенос белковой пленки яа сетки и высушивание производили так же, как и в нервом варианте.
Исследованиями установлено, что при изготовлении образцов по методике Кляйншмидта ориентация молекул в белковой пленке в каком-либо направлении практически отсутствует. Это
о о о о о
Рис. 17, Схематическое изображение одной и той же молекулы, обработанной по методике КдяГшшмидта, оттененной с вращением образца (а) и в одном направлении (б)
заставляет использовать вращение препарата в процессе контрастирования молекул оттенением. Принципиальная схема установки для оттенения с вращающимся столиком объекта показана на рнс. 5, б. Столик вращается при помощи электромотора и делает 2 об/сек.
На рис. 15 приведена типичная микрофотография молекулы ДНК фага Т2. Образцы для электронномикроскопнческих исследований подготавливали по второму варианту методики. Видно, что в условиях работы с белковой пленкой можно получить микрофотографии длинных молекул, располагающихся на сравнительно небольших участках площади пленкн.
На рнс. 16 показан тот же препарат, но контрастнрованнын в одном направлении. Картина оказывается совершенно другой, благодаря тому, что участки молекул, ориентированные вдоль направления оттенения, совершенно не выявляются. Для большей наглядности на рис. 17, а, б показано (соответственно), как выглядит молекула при оттенении с вращением образца и как должна выглядеть прн одностороннем оттененин.
93
Важным обстоятельством является то, что, в отличие от микрофотографий ДНК, полученных при помощи других методов, в данном случае толщина молекул, контрастированных оттененн-ем, составляет 50—80 A. Такое увеличение диаметра связано с образованием комплекса нуклеиновая кислота — белок. Некоторое увеличение толщины молекул (на 10—20 A) может дать круговое напыление металлом.
Схематическое изображение предполагаемой картины распределения металла прн оттененни со всех сторон объекта цилиндрической формы показано на рис. 18. B этом случае нет
Рис. 18. Распределение металла при оттененин со всех сторон объекта цилиндрической формы
участков, на которых отсутствовал бы слой металла, но есть участки с пониженной толщиной этого слоя, расположенные по сторонам цилиндрического объекта, непосредственно на котором слой достигает наибольшей толщины.
Метод белковой пленки успешно применяли для исследования однотяжевой ДНК некоторых фагов [57]. Основная трудность при этом заключается в том, что однотяжевая нуклеиновая кислота не обладает жесткостью, присущей двутяжной, н в растворе имеет форму рыхлого клубка. Чтобы развернуть этот клубок, нужно готовить препарат для электронной микроскопии при низкой ионной силе, а также в условиях, препятствующих ренатурацни, если речь идет о денатурированной ДНК (сильно щелочное pH, присутствие формальдегида). На рнс. 19 представлена микрофотография частично денатурированной ДНК фага Т2, где наряду с двухнитевымн участками вндны фрагменты однонитевой ДНК.
Некоторые вирусы прн резком снижении ионной силы раствора выбрасывают свою нуклеиновую кислоту. Используя метод Кляйншмидта, это явление можно наблюдать электрон-номикроскопически [58]. Для этого суспензию фага Т2 в 8 M аммоннй-ацетатном буфере смешивали с цитохромом с и 0,4 мл смеси наносили на поверхность того же буфера, но с 0,01 М. В образовавшейся белковой пленке некоторые частицы фага выбрасывали ДНК, которая располагалась вокруг фаговой частицы. Аналогичного эффекта можно добиться и другим путем. Мы наносили мелкие капли взвеси фаговых частиц в 5 M аммоннй-ацетатном буфере на внутреннюю поверхность колбы. Затем в колбу наливали воду и тщательно перемешивали. К 1 мл
Предыдущая << 1 .. 29 30 31 32 33 34 < 35 > 36 37 38 39 40 41 .. 126 >> Следующая

Авторские права © 2011 BooksOnChemistry. Все права защищены.
Реклама