Главное меню
Главная О сайте Добавить материалы на сайт Поиск по сайту Карта книг Карта сайта
Книги
Аналитическая химия Ароматерапия Биотехнология Биохимия Высокомолекулярная химия Геохимия Гидрохимия Древесина и продукты ее переработки Другое Журналы История химии Каталитическая химия Квантовая химия Лабораторная техника Лекарственные средства Металлургия Молекулярная химия Неорганическая химия Органическая химия Органические синтезы Парфюмерия Пищевые производства Промышленные производства Резиновое и каучуковое производство Синтез органики Справочники Токсикология Фармацевтика Физическая химия Химия материалов Хроматография Экологическая химия Эксперементальная химия Электрохимия Энергетическая химия
Новые книги
Петрянов-соколов И.В. "Научно популярный журнал химия и жизнь выпуск 2" (Журналы)

Петрянов-соколов И.В. "Научно популярный журнал химия и жизнь выпуск 1" (Журналы)

Петрянов-соколов И.В. "Научно популярный журнал химия и жизнь выпуск 12" (Журналы)

Петрянов-соколов И.В. "Научно популярный журнал химия и жизнь выпуск 11" (Журналы)

Петрянов-соколов И.В. "Научно популярный журнал химия и жизнь выпуск 10" (Журналы)
Книги по химии
booksonchemistry.com -> Добавить материалы на сайт -> Фармацевтика -> Грачева И.М. -> "Лабораторный практикум по технологии ферментных препаратов " -> 58

Лабораторный практикум по технологии ферментных препаратов - Грачева И.М.

Грачева И.М., Грачев Ю.П., Мосичев М.С., Борисенко Е.Г. Лабораторный практикум по технологии ферментных препаратов — М.: Легкая и пищевая промышленность, 1982. — 240 c.
Скачать (прямая ссылка): labpraktikumpotehfermentpreparatov1982.djvu
Предыдущая << 1 .. 52 53 54 55 56 57 < 58 > 59 60 61 62 63 64 .. 69 >> Следующая

Второе занятие
На втором занятии студенты осуществляют следую щие операции:
вводят образец в колонку и фракционируют его; регенерируют колонку; анализируют полученные фракции; строят хроматограммы.
Введение в колонку анализируемого материала и еп фракционирование. При внесении материала в колоню необходимо выполнить два условия: осуществить равно мерное распределение раствора по поверхности геля i не нарушить при этом его упаковку. При внесении ма териала лучше всего пользоваться специальным фирмен ным приспособлением Pharmacia.
При отсутствии приспособления избыток жидкош осторожно отсасывают и на поверхность защитного дис ка медленно, по каплям, из пипетки наносят материал Затем открывают выходной кран и устанавливают нужную скорость протекания раствора. В момент входг последней порции материала в гель кран перекрывают и внутренние стенки омывают минимальным количест вом элюента. После прохождения этой порции добавляют большое количество элюента и колонку соединяют с резервуаром.
Фракции, отбираемые с колонки, можно в дальнейшем объединить в соответствии с кривой оптической плотности элюента при Х = 280 нм, полученной на «Уви-корде» или на спектрофотометре. После элюции колонку отмывают не менее чем двумя объемами буфера.
Регенерация колонки. Эта операция осуществляется простым пропусканием через колонку любого растворителя или (при необходимости удаления механических примесей, попавших в нее в процессе работы) отмучива-нием. Частые перебивки колонки с гелем нецелесообразны, правильно заполненная колонка может быть использована 5—10 раз.
Очень часто в колонках после завершения цикла очистки нарушается правильная укладка верхнего слоя.
особенно в случае мелкозернистых и крупнопористых Частиц. Если размеры повреждения не слишком велики, то можно внести в колонку 0,5—1,0 см3 свежего геля и взмутить столб на глубину 2—3 см.
При длительной работе колонок желательно добавление к пропускаемым растворам антисептиков, таких как хлороформ, толуол, крезол, 0,001 %-ный раствор тио-мертиолата, 0,02%-ный раствор NaN3 и т. п. Использование грыс-буфера обеспечивает нормальную работу колонок в течение длительного времени.
Анализ полученных фракций. Собранные фракции после измерения их оптической плотности используют для определения ферментативной активности (двух и более ферментов).
Построение хроматограммы. В случае отсутствия «Увикорда» можно после замера оптической плотности (1>28о) и определения ферментативной активности во всех фракциях построить хроматограмму, По оси ординат откладывается оптическая плотность; по оси абсцисс — номера фракций. На этом же графике строится зависимость ферментативной активности от номера фракции. По совмещенному графику можно судить о степени разделения комплекса ферментного препарата при данных условиях гельфильтрации.
Третье занятие
На этом занятии студенты калибруют колонку и определяют молекулярную массу фермента.
Калибровать колонку нужно в том случае, если требуется при помощи гельфильтрации определить молекулярную массу неизвестного соединения. В качестве стандартов используют белки, молекулярная масса которых известна, например бычий сывороточный альбумин, бычью рибонуклеазу и бычий у'глобулин. Готовят растворы соответствующих белков, содержащие 10 мг белка в 1 см3. К раствору каждого белка в качестве маркера прибавляют небольшое количество фенолового красного. В колонку вводят 2,5 см3 этого раствора (25 мг белка) и при помощи спектрофотометра определяют содержание белка в соответствующих фракциях. Полученные результаты используют для построения калибровочной кривой, откладывая по оси ординат логарифм Молекулярной массы белка, а по оси абсцисс — номера
соответствующих фракций. В основе данного метода определения молекулярной массы лежат данные Витакера о том, что между логарифмом молекулярной массы указанных выше белков и объемом, в котором они элюируются из данной колонки, существует прямая зависимость.
При пропускании через колонку неизвестного белкового соединения определяем объем, в котором оно элюируется. Затем по калибровочной кривой можно определить его молекулярную массу.
Определение молекулярной массы неизвестного соединения является ответственной задачей, выполнить которую можно, лишь осуществив несколько повторностей опыта (>3), используя полученные результаты для отбраковки грубых ошибок и определения доверительных ошибок (см. приложение I, § 1).
После проведения испытаний составляют протокол наблюдений, включающий характеристику ферментного препарата (его активность, содержание белка, объем пробы, нанесенной на колонку), характеристику колонки (ее диаметр и высоту, марку сефадекса, скорость протекания буферного раствора), результаты анализа полученных фракций (активность в ед./см3 и содержание белка в мкг/см3), хроматограмму и калибровочную кривую.
Лабораторная работа №11 Исследование кинетики ферментативной реакции
Кинетическое исследование представляет собой один из важнейших этапов исследования ферментов, дающих ценные сведения о строении ферментов, их активных центрах и механизме их действия. Эти исследования необходимы для грамотного использования ферментов.
Предыдущая << 1 .. 52 53 54 55 56 57 < 58 > 59 60 61 62 63 64 .. 69 >> Следующая

Авторские права © 2011 BooksOnChemistry. Все права защищены.
Реклама