Главное меню
Главная О сайте Добавить материалы на сайт Поиск по сайту Карта книг Карта сайта
Книги
Аналитическая химия Ароматерапия Биотехнология Биохимия Высокомолекулярная химия Геохимия Гидрохимия Древесина и продукты ее переработки Другое Журналы История химии Каталитическая химия Квантовая химия Лабораторная техника Лекарственные средства Металлургия Молекулярная химия Неорганическая химия Органическая химия Органические синтезы Парфюмерия Пищевые производства Промышленные производства Резиновое и каучуковое производство Синтез органики Справочники Токсикология Фармацевтика Физическая химия Химия материалов Хроматография Экологическая химия Эксперементальная химия Электрохимия Энергетическая химия
Новые книги
Сидельковская Ф.П. "Химия N-вннилпирролидона и его полимеров" ()

Сеидов Н.М. "Новые синтетические каучуки на основе этилена и олефинов" (Высокомолекулярная химия)

Райт П. "Полиуретановые эластомеры" (Высокомолекулярная химия)

Попова Л.А. "Производство карбамидного утеплителя заливочного типа" (Высокомолекулярная химия)

Поляков А.В "Полиэтилен высокого давления. Научно-технические основы промышленного синтеза" (Высокомолекулярная химия)
Книги по химии
booksonchemistry.com -> Добавить материалы на сайт -> Физическая химия -> Владимиров А.А. -> "Физико-химические основы фотобиологических процессов " -> 72

Физико-химические основы фотобиологических процессов - Владимиров А.А.

Владимиров А.А., Потапенко А.Я. Физико-химические основы фотобиологических процессов — М.: Высшая школа, 1989. — 200 c.
Скачать (прямая ссылка): fizikobiologicheskogo1989.djv
Предыдущая << 1 .. 66 67 68 69 70 71 < 72 > 73 74 75 76 77 78 .. 79 >> Следующая


Суспензия светящихся бактерий — удобный объект для определения концентрации антибиотиков и различных токсических соединений, которые угнетают жизнедеятельность бактерий и снижают тем самым интенсивность биолюминесценции.

Но наиболее перспективно, несомненно, применение очищенных препаратов бактериальной люциферазы. Фермент, очищенный от примесей низкомолекулярных соединений, обладает способностью к излучению света лишь в присутствии всех трех субстратов: кислорода, ФМН • H2 и длинноцепочечного альдегида (с длиной цепи не менее 8 углеродных атомов). Добавив к

185 Таблица 9.2. Примеры использования бактериальной люминесценции в аналитической биохимии

Применяемый препарат Анализируемое соединение Чувствительность метода
ФБ*: Photobacterium ФБ: Ph. Ieiognathi Кислород Антибиотики: хлортетрациклин грамицидин С 0,01 — 1 нмоль/л 30—60 Ед/мл 20—30 Ед/мл
МШ: Beneckia harvegi Миристат (липазы) Миристат (полисахариды) 10 пмоль/мин 10 пмоль/мин
МШ: Beneckia harvegi Мутагены (обратные мутации нг
ФБ Различные токсические вещества нг
Л + ФМН-Н2 Альдегиды Феромоны 0,5 пмоль 0,01 пмоль
Л + А ФМН и ФАД (после гидролиза и восстановления до ФМН-H2) 0,01 фмоль
Л+ОР+А+ФМН НАДН 0,01 — 1 пмоль
Л+ OP+ А+ НАД-H ФМН (без процедуры восстановления до ФМН H2) IO^14-IO"7 моль
Л+ОР+А+ФМН+ + НАД + + ДГ Субстрат дегидрогеназы пмоли
Л+ОР+А+ФМН+ + HАД + + субстрат ДГ Активность дегидрогеназ »
Л+ОР+А+ФМН+ НАД + + Г + ГК + ГДГ АТФ »

* Сокращения: А—алифатический альдегид (обычно C15); Г — глюкоза; ГК — гексо-киназа; ГДГ—глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа; ДГ — дегидрогеназы; Jl—бактериальная люцифераза, МШ — мутантный штамм светящейся бактерии, ФБ — суспензия светящихся бактерий, OP — никотинамид-флавинмононуклеотид оксидоредуктаза

изолированной бактериальной люциферазе ФМН • H2, исследователь получает высокочувствительную систему для определения алифатических альдегидов; к их числу принадлежат, в частности, половые гормоны насекомых, феромоны, которые обнаруживаются в количестве IO"14 моль, что позволяет изучать метаболизм этих веществ у одной особи. В медицине обещает найти широкое применение анализ содержания ФМН и ФАД, основанный на биолюминесцентном определении ФМН • H2, образующегося из окисленных форм флавиннуклеотидов при их предварительном восстановлении.

Наиболее широкое применение в биохимических и клинических лабораторных анализах обещает получить препарат, состоящий из смеси двух компонентов (ферментов): бактериальной люциферазы и НАДН: ФМН-оксидоредуктазы.

186 В отечественном наборе КРАБ (комплект реактивов для анализа биолюминесценции) содержатся люцифераза и оксидоре-дуктаза, выделенные из биомассы светящихся бактерий. Добавив к препарату в присутствии С15-альдегида НАДН, получается высокочувствительный реактив для определения ФМН (без его предварительного восстановления):

НАДН + ФМН -°к-сидорсдуктаза ,.НАД + ФМН • H2 ^«ифераза^ -> Биолюминесценция

Наоборот, если добавить к смеси люциферазы и оксидоредукта-зы альдегид и ФМН, то такая смесь может использоваться как биолюминесцентная тест-система для количественного определения НАДН в биологических материалах; схема реакций такая же.

Удлиняя цепочку биохимических стадий, предшествующих биолюминесценции, можно получить все новые аналитические возможности. Для определения активности ферментов дегидроге-наз или (альтернативно) для определения концентрации субстратов этих ферментов используется следующая тест-система:

Люцифераза + Оксидоредуктаза + Альдегид + ФМН + НАД +

В присутствии субстрата какой-либо дегидрогеназы, например в присутствии лактата, можно определять по биолюминесценции активность соответствующей дегидрогеназы (в нашем примере активность ЛДГ, лактатдегидрогеназы):

Субстрат + НАД + + Дегидрогеназа-> НА Д H ->

и далее по схеме, приведенной выше.

В присутствии изолированной дегидрогеназы можно определять концентрацию субстрата этого фермента в интересующей нас химической или биохимической системе (схема реакций та же).

Примером еще более сложной смеси может служить набор для определения АТФ. Он включает в себя 4 фермента и субстраты:

Глюкоза + Гексокиназа + Глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназа +

+ НАДН: ФМН-оксидоредуктаза + Люцифераза + НАД + + ФМН + альдегид

Схема реакций при определении АТФ с использованием бактериальной люминесценции имеет внушительный вид:

Глюкоза + АТФ 1ексок,ша,а • Гл юкозо-6-фосфат-- ' ,,ЛД ' ^дро.-еназ^

->НАДН— Оксидоредуктаза__, фМH H - +Альдегид, Люцифераза

-> Биолюминесценция

Несмотря на то что для аналитического определения АТФ таким способом нужно четыре ферментных препарата, существует

187 мнение, что этот метод вытеснит со временем применение люциферазы светляков, так как ловить насекомых во время лёта труднее, чем выращивать бактерии. Впрочем, развитие генной инженерии может привести к биотехнической выработке светляко-вой люциферазы в достаточных количествах.

ЛИТЕРАТУРА

Использованная литература

Барлтроп Дж., Койл Дж. Возбужденные состояния в органической химии.— M.: Мир, 1978.
Предыдущая << 1 .. 66 67 68 69 70 71 < 72 > 73 74 75 76 77 78 .. 79 >> Следующая

Авторские права © 2011 BooksOnChemistry. Все права защищены.
Реклама