|
Химия природных соединений - Кочетков Н.К.Скачать (прямая ссылка):  Ряд методов определения N-концевых аминокислот основан на алки-лировании или ацилировании пептида и последующем гидролизе. В гидролизате концевая аминокислота обнаруживается в виде алкильного или ацильного производного. Наиболее важным и детально разработанным методом является метод динитрофенилирования белка, предложенный в 1945 г. Зангером и использованный им при установлении строения инсулина. Пептид (или белок) обрабатывают 2,4-динитрофторбензолом в слабо щелочной среде (pH 9) при 20—25°. Образующиеся 2,4-динитрофе-нильные производные не распадаются во время кислотного гидролиза 510 пептидов и белков (исключение составляют динитрофенильные производные глицина, цистина, пролина и триптофана). Динитрофенильные производные аминокислот представляют собою кристаллические соединения, окрашенные в желтый цвет. Вследствие оттягивания электронов динитрофенилированным бензольным кольцом они обладают ясно выраженными кислыми свойствами, легко разделяются электрофорезом и хроматографией и определяются спектрофотометрически. Инграм предложил использовать для определения концевых амин-ных групп реакцию восстановительного метилирования по Бауману. При действии на пептиды формальдегидом и одновременном восстановлении над палладием образуются N-диметильные производные пептидов, гидролизующиеся до диметиламинокислоты и аминокислот. R—CH—CO—NH—CH(R')—CONHCH(R")CO . . . +H2/Pd-fHCOH------ I NH* H2OtH- R—CH—CONHCH(R')—CONHCH(R")CO . . .------- N(CH3)2 R-CH-COOH+R —CH-COOH . . . I I N(CH3)2 NH2 Диметиламинокислоты не реагируют с нингидрином и их проявляют орцином, тимоловым синим и т. д. Вследствие тенденции метильных групп к подаче электронов заряд на азоте диметиламинокислот несколько повышен, амфотерные свойства их выражены столь же ярко, как и у самих аминокислот. Разделение их методами электрофореза и хроматографией менее четко, чем разделение динитрофенильных производных аминокислот. Диметильные производные аминокислот не имеют широкого применения при исследованиях строения пептидов. Метод ацилирования белков, широко применявшийся в начале столетия, сейчас потерял свое значение, так как большинство ацильных производных гидролизуются аналогично пептидной связи. Исключение составляет остаток n-иодбензолсульфокислоты (пипсил), который связывается с аминогруппой прочнее, чем динитрофенильный остаток. .Обычно применяют пипсилхлорид, содержащий иод 135. Ji-5-^ V-SQ2Cl-fNH2CH(R)CONHCH(R')CO . ..-> _» JU5_^ —SOaNHCH(R)CONH—CH(R')CO . . . Пипсиламинокислоты можно отделить хроматографически, противоточ-ным распределением или определить, пользуясь радиохроматограммой. Пипсильную защиту полезно применять в тех случаях, когда N-конце-вым остатком являются глицин, цистин, пролин или триптофан. Ряд методов основан на получении таких производных пептидов, которые в кислой среде распадаются с образованием циклических соединений, отщепляющихся от пептида. К ним относятся изоцианатные, тиоизоцианатные, карбаминовые и аналогичные производные. Наиболее важным из этих реактивов является фенилизоцианат и фенилизотиоциа-нат, использовать который предложил Эдман. При действии на пептид, например, фенилизотиоцианата в щелочной среде образуется фенил-изотиоциановое производное. ОН' C6H6NCS+NH2CH(R)CONHCH(R')CO . .----» C0HsNHCSNHCH(R)CONHCH(R')CO . .. 511 При осторожном нагревании с HCl в нитрометане оно диклизуется с распадом на фенилтиогидантоин и пептид. if R-CH-CO—NCH(R')CO ... н- R—CH—CO I I \ +NH2-CH(R1)CO. . NH NHC6H5 HN NC6H6 xCs/ ^csy который извлекают в органический растворитель и определяют как таковой или гидролизуют до аминокислоты. Оставшийся пептид можно подвергнуть вторичной обработке фе-нилизотиодианатом и отщепить следующий аминокислотный остаток. Таким образом, этот метод пригоден также и для установления последовательности аминокислотных остатков в пептидах. Френкель-Конрат видоизменил метод для микроопределения аминокислотных остатков в виде фенилтиогидантоинов на бумаге и определил с его помощью первые 8 аминокислот в кортикотропине. Остальные приведенные ниже методы, основанные на образовании циклических производных, имеют ограниченное значение. а. Пептид обрабатывают сероуглеродом и получают дитиокарбами-новое производное (I), которое в кислой среде при комнатной температуре расщепляется на 2-тио-5-тиазолидон и пептид. Тиазолидон (II) можно извлечь органическим растворителем. ОН' н* CS2+NH2CH(R)CONHCH(R)CO . . . »HSCS—NH-CH(R)CONHCH(R)CO . . . R—CH—CO I j \s+NH2-CH(R)CO . . . NH-CS II б. При реакции пептида с эфиром ацилтиокарбаминовой кислоты (I) получают N-ацилтиокарбаминовое производное пептида (II); оно распадается в кислой среде на тиогидантоин и пептид, содержащий, также как и в описанных выше случаях, на один аминокислотный остаток меньше, чем исходный пептид. OH' RCONHCSR+NH2CH(R)CO-NHCH(R)CO . . .-----* S I Il H- RCGNHCNHCH(R)CO—NHCH(R)CO . . .---> NH-CHR+ NH2CH(R)CO . . . I I
Авторские права © 2011 BooksOnChemistry. Все права защищены. |
|
|||||||||||||||||||||||||
|
|
|
||||||||||||||||||||||||||
