|
Химия природных соединений - Кочетков Н.К.Скачать (прямая ссылка):  II CS CO \/ NH Большое значение приобрели в последнее время ферментативные методы, которые позволяют не только устанавливать N- и С-концевые аминокислотные остатки, но и чередование их в пептиде и белке. Для определения N-концевой аминокислоты пользуются лейцинами-нопептидазой, выделяемой из слизистой оболочки кишечника. Лейцин-аминопептидаза расщепляет экзопептидную связь, образованную аминокислотным остатком, содержащим свободную аминогруппу. При этом происходит ступенчатая деградация пептида. аминопептидаза NH2CH(R)CONHCH(R)CONHCH(R)CO . . .--------> N^2CIf(R)COOH+NH2CH(R)CONHCH(R)CO . . . и далее о Методы определения С-концевых аминокислот пептидов и белков менее разработаны. Следует остановиться на трех способах. 1. Селективное восстановление карбоксильной группы. При обработке пептида или его эфира мягкими восстановителями LiAlH4, LiBH4l AlH3 карбоксильная группа восстанавливается до спиртовой. Восстановленный пептид подвергают гидролизу и в гидролизате наряду с аминокислотами обнаруживают аминоспирт, соответствующий концевой С-аминокислоте. Его можно извлечь в органический растворитель и определить хроматографически или превратить в пикрат или динитро-фенильное производное: . . . NHCH(R)CO—NHCH(R)CO—NHCH(R)COOH-I-LiAlH1 - . . . NHCH(R)CO-NHCH(R)CO-NHCH(R)CHiiOH — . . . NHjtCH(R)COOH+NH2CH(R)COOH+NH2CH(R)CH2OH“ Детальное изучение реакция показало, что LiAlH4 может при длительном воздействии и более жестких условиях восстанавливать и пептидную связь. 2. Гидразинолиз — метод Акабори. Амиды кислот реагируют с гидразином, образуя гидразиды кислот и аммиак. RCHii-CONH2-I-NH2-NH2 > RCH2-CONHNHa+NH3 Пептиды реагируют также пептидной группой с образованием гидра-зидов аминокислот. He вступает в реакцию только С-концевая аминокислота, поскольку карбоксильная группа не реагирует с гидразином. NH2-CH-CONH-CH-CONH-CH-CONH-CH-COOH+NH2—NH2 —> Illl R R' R" Rw NH2-CH- C0NH«+NH21I#*^-CH—CONHNH2+NH2—CH-CONHNH2+NH2—CH-COOH I Іи,? I I, I R R' R' Rr" Для отделения аминокислоты от гидразидов аминокислот смесь обрабатывают альдегидом, который образует с гидразидаїми труднорастворимые гидразоны. С-концевую аминокислоту определяют хроматографически. Этим методом не всегда удается получить хорошие результаты. Реакция проводится в сравнительно жестких условиях, при которых частично распадаются цистин, аспарагин, глутамин и аргинин. Все же этот метод является одним из широко применяемых. 3. Ферментативное расщепление пептида с С-конца. Для этого пользуются карбоксипептидазой, выделяемой из поджелудочной железы крупного рогатого скота. Карбоксипептидаза расщепляет экзо-пептидную связь, образованную аминокислотным остатком со свободной карбоксильной группой. карбоксипептидаза . . . NHCH(R)CONHCH(R)CO—NHCH(R)CO-NHCH(R)COOH------------- . . . NHCH(R)CO-NHCH(R)CONHCH(R)COOH+NH2CH(R)COOH Из всех методов определения С-концевых аминокислот этот метод самый специфичный. Пользуясь карбоксипептидазой также, как при действии аминопептидазой, можно определять не только С-концевую аминокислоту, но и последовательно отщеплять аминокислотные остатки с С-конца пептида. Реакция обрывается, когда в пептидной цепи встречается пролин, так как карбоксипептидаза не гидролизует связь CO—N. 513 Таким образом ферментативные методы дают возможность не только определять N и С-концевые аминокислоты, но и устанавливать порядок чередования аминокислотных остатков на N- и С-концах пептидов. Следующей задачей при определении строения пептидов является установление характера связи и последовательности аминокислотных остатков в молекуле пептида или белка. Эта задача, трудно выполнимая в настоящее время для белков с большим молекулярным весом, облегчается тем, что в природе встречается значительное число относительно низкомолекулярных соединений, представляющих собою пептиды. Виланд предлагает различать три группы природных пептидов: олигопептиды, состоящие из 2—10 аминокислот, полипептиды, состоящие из 10—100 аминокислот, и макропептиды, к которым относятся собственно белки. Изучение природных пептидов представляет собой важный этап в подходе к изучению строения белка. Исследование обычно начинают с определения числа цепей, входящих в состав объекта изучения. Для этого пользуются одним из ранее приведенных методов, например динитрофенилированием, действием азотистой кислоты или аминопептидазы для определения N-концевой аминокислоты и восстановлением, гидразинолизом или действием карбоксипептидазы для определения С-концевого остатка (см. стр. 510 и далее). Самый совершенный метод установления последовательности аминокислот в пептиде заключался бы в постепенном отщеплении их от по-липептидной цепи, подобно тому, как синтез пептида проводят последовательным нанизыванием аминокислотных остатков. Для этой цели в настоящее время можно было бы воспользоваться методом Эдмана—последовательным отщеплением аминокислот в виде фенилтиогидантоинов (см. стр. 511). Широко применяют также кар-боксипептидазу и аминопептидазу.
Авторские права © 2011 BooksOnChemistry. Все права защищены. |
|
|||||||||||||||||||||||||
|
|
|
||||||||||||||||||||||||||
