Главное меню
Главная О сайте Добавить материалы на сайт Поиск по сайту Карта книг Карта сайта
Книги
Аналитическая химия Ароматерапия Биотехнология Биохимия Высокомолекулярная химия Геохимия Гидрохимия Древесина и продукты ее переработки Другое Журналы История химии Каталитическая химия Квантовая химия Лабораторная техника Лекарственные средства Металлургия Молекулярная химия Неорганическая химия Органическая химия Органические синтезы Парфюмерия Пищевые производства Промышленные производства Резиновое и каучуковое производство Синтез органики Справочники Токсикология Фармацевтика Физическая химия Химия материалов Хроматография Экологическая химия Эксперементальная химия Электрохимия Энергетическая химия
Новые книги
Сидельковская Ф.П. "Химия N-вннилпирролидона и его полимеров" ()

Сеидов Н.М. "Новые синтетические каучуки на основе этилена и олефинов" (Высокомолекулярная химия)

Райт П. "Полиуретановые эластомеры" (Высокомолекулярная химия)

Попова Л.А. "Производство карбамидного утеплителя заливочного типа" (Высокомолекулярная химия)

Поляков А.В "Полиэтилен высокого давления. Научно-технические основы промышленного синтеза" (Высокомолекулярная химия)
Книги по химии
booksonchemistry.com -> Добавить материалы на сайт -> Другое -> Лакович Дж. -> "Основы флуоресцентной спектроскопии" -> 58

Основы флуоресцентной спектроскопии - Лакович Дж.

Лакович Дж. Основы флуоресцентной спектроскопии — М.: Мир, 1986. — 496 c.
Скачать (прямая ссылка): osnovifluriscentnoyspektroskopii1986.djv
Предыдущая << 1 .. 52 53 54 55 56 57 < 58 > 59 60 61 62 63 64 .. 185 >> Следующая

Температура, °С 60,3 39,5 21,0 4,8
Ю3/Г, H~f
РИС. 5.13. Значения кажущейся микровязкости, полученные из измерений анизотропии DPII [15].
Приведены значения натурального логарифма кажущейся микровязкости от обратной температуры для малых однослойных везикул, приготовленных из DOPC (1), DMPC (2), DPPC (3), DS PC' (4).
Очевидно, что измерения анизотропии флуоресценции могут значительно расширить возможности изучения физико-химических свойств липидных бислоев. Однако важно понять и запомнить допущения, которые были сделаны при оценке микровязкости. Главное из них состоит в том, что градуировочная кривая, построенная при использовании изотропного растворителя сравнения, пригодна для флуорофоров, распределенных в анизотропное окружение липидных бислоев. Приходится принимать, .что деполяриза-ционные движения флуорофора идентичны в таком разном окружении. Это предположение было проверено несколькими другими методами (разд. 6.2.1), и в настоящее время известно, что оно некорректно: в липидных бислоях диффузионные движения флуорофоров обычно затруднены, т.е. флуорофоры не могут вращаться больше чем на определенный угол. В изотропном растворителе сравнения подобных угловых ограничений нет. Это не умаляет пользы измерений анизотропии для изучения клеточных мембран, но показывает, что нужно быть осторожным в интерпретации получаемых значений микровязкости.
5„7„20 Вращательная диффузия белков
Первым биохимическим применением метода поляризационной флуоресценции была оценка времен вращательной корреляции белков [ 16]. Общепринятым подходом является ковалентное маркирование белка внешним флуоро-
фором. Флуорофор выбирают главным образом на основании времени затухания флуоресценции. Время затухания должно быть сравнимо с предполагаемым временем вращательной корреляции белка. Таким образом, анизотропия будет отражать изменение этого параметра [ уравнения (5.44) и (5.49)]. Обычно поляризация флуоресценции определяется из ее зависимости от Т/r). Температуру изменяют обычным способом, а вязкость ~ путем добавления сахара. График строят в координатах либо (1 /Р- 1/3), либо 1 /г от Т/т) (рис. 5.14). Экспериментально доступен только ограниченный диапазон значений Т/ц. При высокой температуре ограничение связано с нестабильностью белков, а при низкой - с замерзанием и изменением растворимости. Отсекаемый отрезок на оси у должен быть равен (1 /Р0 - 1/3) или (1 /г0), где Р0 и г 0 - значения, получаемые для того же флуорофора в стеклообразном растворе. В первом приближении Р0(г0) можно считать свойством флуорофора Ближайшее окружение может влиять на Р0, но влияние обычно мало и сравнимо по величине с влиянием растворителя на спектр поглощения флуорофора. В следующем параграфе мы обсудим причины различий в экстраполированных значениях Р0. Если время затухания флуоресценции известно, объем молекулы белка может быть вычислен из наклона и отсекаемого отрезка графика Перрена (рис. 5.14). Объем связан с временем вращательной корреляции белка уравнением (5.41).
Для глобулярных белков время вращательной корреляции приближенно связано с молекулярной массой М белка соотношением
(5.50)
^ ''Сегментальная ,/• подвижность
Г/Ч
РИС. 5.14. График Перрена для оценки молекулярных объемов. Штриховой линией показано влияние сегментальных движений зонда.
где v — удельный объем белка; h - величина гидратации (обычно 0,2 г НаО на 1 г белка). По уравнению (5.50) можно найти, что время корреляции гидратированного белка приблизительно на 12 % больше, чем предполагается для безводной сферы. Обычно наблюдаемые значения <р приблизительно в два раза больше, чем предполагаемые для безводной сферы [ 17]. Большие наблюдаемые значения являются, вероятно, результатом того, что большинство белков имеет несферическую форму и эффективная оболочка растворителя больше для вращательной диффузии, чем для гидратации.
В реальных экспериментах часто получаются разные результаты в зависимости от того, что именно варьируется - температура или вязкость. Типичные результаты для иммуноглобулина G, маркированного диметиламино-нафталин-5-сульфохлоридом, приведены на рис. 5.15. Главным и в то же время вводящим в заблуждение свойством координат Перрена является увеличение экстраполируемого значения 1 /Р0 (уменьшение значения Р0) по мере увеличения температуры. Такое поведение обычно приписывают гибкости зонда на макромолекуле.
РИС. 5.15. Поляризация флуоресценции DNS-y-HMMyHornofivnnHa [18]. а - прямые проведены через точки, полученные при одной и той же температуре. б - прямые проведены через точки, измеренные при разных температурах. На обоих рисунках одни и те, же данные.
На вопрос, какое значение Р0 следует использовать для вычисления времени вращательной корреляции белка - экстраполированное (Р0') или значение для замороженного раствора (Р0), - полностью корректного ответа нет, и нужно рассматривать специфические особенности каждого отдельного эксперимента. Обычно экстраполированное значение Р0' дает лучшую оиенку <р, поскольку в нем учитывается сегментальное движение зонда и частично вычитается влияние этого движения на вычисленное значение <р. Например, предположим, что сегментальное движение флуорофора значительно быстрее, чем вращательная диффузия белка. Тогда значение Р0 эффективно снижается:
Предыдущая << 1 .. 52 53 54 55 56 57 < 58 > 59 60 61 62 63 64 .. 185 >> Следующая

Авторские права © 2011 BooksOnChemistry. Все права защищены.
Реклама